Sobre o artigo de Klotz & Rintelen 2014 - Identidade do Caridina “Crystal/Bee”

Introdução – identificação de espécies através de testes genéticos

Ferramentas moleculares de identificação foram desenvolvidas inicialmente para estudar relações entre indivíduos, desde simples Testes de Paternidade até estudos de árvores filogenéticas entre espécies. Uma aplicação direta desta tecnologia é a identificação de espécies baseada em amostras teciduais. Tem extenso uso em veterinária forense, identificando espécies a partir de carcaças ou pequenas amostras de sangue e tecidos. Um exemplo interessante é a identificação de espécies protegidas e ilegais de baleias a partir de amostras de carne comercializada em mercados asiáticos.

As técnicas mais tradicionais utilizavam testes imunes e eletroforese de proteínas, mas têm sido cada vez mais substituídos por novas ferramentas usando ácidos nucleicos, com uma série de vantagens em termos de sensibilidade, especificidade e acurácia. Além da precisão muito superior, a análise pode ser feita a partir de amostras pequenas, mais degradadas, ou fixadas em coleções.

Estruturas de uma típica célula eucariótica, destaque para Mitocôndria e Núcleo celular. Ilustração de CFCF para Anatomy & Physiology, Connexions Web site. Licença Creative Commons. Arquivo original pode ser visto aqui

DNA mitocondrial e DNA nuclear

Quando se pensa em DNA no interior da célula, imediatamente vem à mente o material genético encontrado no núcleo celular. Na reprodução sexuada, há fusão do DNA nuclear (nDNA) do espermatozóide e do óvulo, por exemplo em seres humanos, os 23 cromossomos do pai e os 23 da mãe se combinam, totalizando os 46 cromossomos das nossas células. Porém, existe outro local dentro da célula onde existe DNA: na mitocôndria. Possui um sistema próprio de replicação, transcrição e translação.

Com poucas exceções, as células de espécies eucarióticas possuem mitocôndrias, uma diminuta organela envolta por uma membrana própria, que gera boa parte do ATP (fonte de energia) da célula. É uma organela muito especial, porque é a única que possui um material genético próprio. Acredita-se que a mitocôndria seja um vestígio de uma bactéria endosimbionte que foi incorporada no citoplasma da célula hospedeiro em algum momento do seu passado evolutivo.

Já vimos que há combinação do nDNA paterno e materno quando há reprodução. Porém, na grande maioria dos organismos com reprodução sexuada, o DNA mitocondrial (mtDNA) é herdado somente da mãe. O mtDNA do pai é destruído ou não-incorporado no processo.

O mtDNA do filho é idêntico ao mtDNA da mãe. Porém, ao longo de muitas e muitas gerações, o mtDNA tem uma relativamente alta e constante taxa de mutação, com uma velocidade de evolução acelerada. Implica em variações de sequência de graus variados que podem ser detectados e quantificados, a fim de graduar a distância evolutiva dentre espécies, ou mesmo indivíduos de uma mesma espécie. Estas pequenas variações também permitem identificar locais de ramificações de ancestralidade, e construir complexas árvores filogenéticas. Já que a taxa de mutação destes genes é sabida, pode-se estimar também o momento quando estas bifurcações ocorreram no passado. Por este motivo, alguns chamam o mtDNA de “relógio molecular”.

Em 1987, o mtDNA foi usada por cientistas da Nature para traçar uma ancestralidade materna dos seres humanos até a África, a famosa “Eva” mitocondrial de 200.000 anos atrás.

Em cada célula de mamíferos, há cerca de 1700 mitocôndrias, respondendo por cerca de 1~2% do total de DNA. Em seres humanos, há 37 genes em cada mitocôndria, e 70.000 genes nucleares em cada núcleo celular. Embora a quantidade total de genes do nDNA seja muito maior, e, neste sentido, a identificação de espécies seja mais precisa usando-se esta ferramenta, a taxa de mutação de nDNA é mais baixa, espécies diferentes mas próximas podem ter muitos loci em comum, e serem indistinguíveis.

Estas diferenças entre nDNA e mtDNA são bastante interessantes, e trazem vantagens e desvantagens para análises isoladas dos dois tipos de material genético. Geralmente são usadas preferencialmente mtDNA, mais simples, facilitando bastante a interpretação dos resultados de árvores genéticas. Em comparação ao nDNA, o mtDNA pode ser isolado de amostras de cabelo, de amostras teciduais degradadas e escassas, já que possui muitas cópias por célula.

Caridina logemanni, foto de Chris Lukhaup.

Metodologia do trabalho dos Drs. Klotz e Rintelen

Em 2014, os Drs. Werner Klotz e Thomas von Rintelen publicaram na revista Zootaxa o artigo intitulado To “bee” or not to be — on some Ornamental Shrimp from Guangdong Province, Southern China and Hong Kong SAR, with Descriptions of Three New Species. O trabalho é muito rico, com descrições de novas espécies, seus estágios larvares, relações filogenéticas, etc. Além da repercussão no meio científico, o artigo foi bastante comentado em meios aquarísticos (fóruns, sites, blogs), pela descrição de duas novas espécies: a primeira é o Caridina mariae, que é o “Tiger Shrimp” criado há muito tempo em aquários, mas cuja espécie não havia sido identificada ainda. A segunda é a Caridina logemanni, que foi interpretada como sendo a espécie de aquários “Bee Shrimp” ou “Crystal Shrimp”. Quanto ao C. logemanni, veremos que não é exatamente isso, a verdade é um pouco mais complexa.

De fato, os autores fizeram uma interessante descoberta, uma nova espécie de camarão que tem o aspecto idêntico aos “Bee” selvagens tradicionalmente criados em aquários, batizada de Caridina logemanni.  Existem diversas outras espécies com faixas escuras e claras largas (“padrão Bee”, como o C. trifasciata, C. maculata, C. venusta e Paracaridina zjinica, inclusive com mutações vermelhas), mas a que mais se parece com o “Bee” selvagem é o C. logemanni. Foi coletado somente em três pequenos córregos montanhosos na região dos Novos Territórios, Hong Kong. Nenhuma outra espécie de camarão vivia junto com eles, mas grandes populações de C. cantonensis, uma espécie com ampla distribuição na região, eram encontradas em riachos próximos.

Apesar de serem espécies bastante próximas filogeneticamente, o aspecto das duas difere bastante: O C. logemanni tem o típico aspecto de “Bee”, com várias faixas largas de cor marrom enegrecida na carapaça e abdômen, enquanto o C. cantonensis não tem faixas, somente um corpo homogêneo translúcido com pequenas manchas escuras (veja fotos).

Foram realizadas também análises genéticas para a identificação das diversas espécies. Excetuando-se as Paracaridinas, Tigers e grupos de controle, foi realizada a análise molecular de 53 espécimes de Caridina, na sua maioria de exemplares selvagens coletados, mas que incluíam também 10 camarões comprados em lojas de aquarismo (dois de lojas chinesas, e o restante de criações de aquaristas conhecidos dos autores).

Foi realizada a análise de dois genes do mtDNA, o “16S” (que codifica o 16S rRNA, envolvido na síntese proteica mitocondrial) e “COI” (que codifica a subunidade I da enzima Citocromo Oxidase , envolvido na fosforilação oxidativa).

Dos 10 exemplares ornamentais de aquário (todos com faixas, “padrão Bee”), os resultados foram (para 16S):

• 2 camarões comprados em lojas da China: formam um clado irmão aos identificados como C. trifasciata, mas com uma distância grande o suficiente para sugerir se tratar de uma espécie distinta.
• 10 camarões de criações em aquários (com “padrão Bee”):
• Dois camarões foram identificados morfologicamente e geneticamente como C. venusta.
• Cinco camarões estão inseridos geneticamente no clado do C. cantonensis.
• Um camarão foi identificado morfologicamente como C. logemanni, mas geneticamente se agrupa com os cinco acima, dentro do clado C. cantonensis.

A COI não pôde ser amplificada em vários espécimes, resultando em um conjunto de dados menor. Somente foi possível analisar dois exemplares de aquário, um dos que formam um clado irmão ao C. trifasciata, e um dos inseridos no clado do C. cantonensis. Ou seja, confirmam e reforçam os achados do 16S.

Caridina cantonensis, foto de Paul Ng Y.C.

Conclusões do trabalho - Identidade do Caridina “Crystal/Bee”?

Parece claro que alguns camarões ornamentais de aquário pertencem às espécies C. venusta e C. trifasciata (ou uma espécie muito próxima a esta última). Estas duas espécies mostram um fenótipo do tipo “Bee”, mesmo em animais coletados na natureza. Deve-se concluir que uma parcela dos camarões “Bee” criada em aquários no mundo devem ser destas duas espécies.

A grande dúvida é em relação aos demais seis camarões (60% dos espécimes ornamentais analisados), todos com um fenótipo “Bee”. Somente um foi identificado morfologicamente como C. logemanni, os demais têm morfologia indeterminada, mas com um padrão “Bee”. Curiosamente, todos os seis (inclusive aquele com morfologia de C. logemanni) foram identificados geneticamente como C. cantonenis, uma espécie sem faixas. Como isto é possível?

O problema dos híbridos

Para o mtDNA, híbridos possuem somente a assinatura genética da sua herança materna. Desta forma, uma análise isolada do mtDNA não é adequada para a identificação de espécies, nos casos onde existe a possibilidade de hibridização, como populações em zonas de fronteira entre distribuição de duas espécies próximas, ou criação conjunta em cativeiro de duas espécies próximas. Nestes casos, dados mitocondriais devem ser suplementados com ferramentas moleculares baseadas em genes nucleares, que têm herança biparental.

Na realidade, a simples discordância entre a análise do mtDNA e nDNA (neste último, seja por análises cromossômicas ou fenotípicas) é uma boa dica de que pode ter havido hibridização. A famosa teoria da nossa hibridização com Neandertais é baseada nisto. Um trabalho recente (2008) brasileiro estudou híbridos de Tartaruga-de-pente (Eretmochelys imbricata) e Tartaruga-cabeçuda (Caretta caretta) usando esta metodologia. Já foi usado em grandes gatos, para identificar híbridos (entre sub-espécies) de Leões Africanos (Panthera leo leo) e Asiáticos (Panthera leo persica), assim como híbridos entre Tigres de Bengala (Panthera tigris tigris) e Siberianos (Panthera tigris altaica).

É um fenômeno chamado de Introgressão Mitocondrial (Evolução Reticulada), ou seja, a inserção de mtDNA de uma espécie em indivíduos de outra espécie, através de hibridização pregressa, e o cruzamento deste híbrido com a população da espécie original. É um fato bastante raro em crustáceos decápodes, porque nestes, o sexo feminino é o heterogamético (WZ), e, segundo a Lei de Haldane, híbridos heterogaméticos são mais raros, frágeis e estéreis, limitando a propagação do mtDNA de linhagem materna.

Mas parece que foi o que ocorreu no trabalho dos Drs. Klotz e Rintelen: camarões com mtDNA de C. cantonensis e nDNA (fenótipo) “Bee” (ou seja, não-C. cantonensis, por exemplo de C. logemanni). São prováveis híbridos de C. cantonensis com outra(s) espécie(s) com faixas, como o C. logemanni (veja ilustração abaixo, híbrido da última linha, F4 da direita).

Dois questionamentos interessantes, o primeiro é o seguinte: se as duas espécies eram criadas juntas e se hibridizaram, porque não encontramos também o inverso? Fenótipo (nDNA) de C. cantonensis e mtDNA de, por exemplo, C. logemanni? A resposta é muito simples: um fenótipo de C. cantonensis não é um padrão “Bee”, não é atrativo do ponto de vista ornamental. Ou seja, se estes híbridos existiram, provavelmente foram eliminadas pela simples seleção do aquarista. Existem outras explicações possíveis, nem sempre os híbridos têm sobrevida e fecundidade iguais, a depender de que espécie foi o pai e qual foi a mãe. Mas a explicação mais provável é esta.

Caridina venusta, foto de Werner Klotz.

Um último aspecto importante, a rigor, os dois camarões de aquário que foram identificados morfologicamente e geneticamente como Caridina venusta podem ser híbridos também. Diferente dos dois exemplares comprados em lojas da China (possivelmente coletados), estes dois animais provêm de uma população criada em aquários há algum tempo, com uma probabilidade razoável de haver hibridização. Embora tanto o mtDNA quanto o fenótipo apontem para C. venusta, talvez seja prudente no futuro realizar alguma análise de genes cromossômicos, provas imunes ou proteicas, para se excluir um híbrido (veja ilustração abaixo, híbrido da última linha, F4 da esquerda).

Porém, neste caso, é improvável que sejam híbridos do mesmo complexo do C. cantonensis / C. logemanni, devido à grande distância filogenética com estas espécies. Talvez trate-se de um outro grupo de espécies que se hibridizaram, do complexo C. maculata / C. venusta. Esta "dupla origem" dos "Bee Shrimp" ornamentais que compõem a população de aquários é defendida por alguns pesquisadores, especialmente asiáticos. Ou seja, talvez os "Bee" ornamentais criados por gerações em aquários do mundo sejam uma mistura de duas populações: Híbridos do grupo maculata-venusta (que compõe a população original desenvolvida pelo Sr. Suzuki desde 1993), e híbridos do grupo cantonensis-logemanni, introduzidos posteriormente por criadores alemães.

Ilustração mostrando hibridização e introgressão mitocondrial. No exemplo, o casal original (F0) foi de Caridina cantonensis, uma espécie sem faixas, e Caridina logemanni, uma típica espécie com faixas. Os híbridos do sexo feminino transmitem adiante o mtDNA da ancestral feminina original (C. cantonensis). Note que, após muitas gerações, como os dois híbridos da última linha (F4), o fenótipo da espécie inserida no cruzamento (C. cantonensis) se dilui, e é difícil de ser detectada. O F4 da direita é o exemplo no texto de fenótipo de C. logemanni e mtDNA de C. cantonensis. O F4 da esquerda é o exemplo no texto de fenótipo concordante com o mtDNA, mas que é híbrido. Ilustração de Walther Ishikawa.

Conclusões (agora sim!) - Identidade do Caridina “Crystal/Bee”

Agora, se o camarão ornamental foi comprado em lojas, e é resultado de uma linhagem criada em cativeiro a várias gerações, trata-se de um grupo heterogêneo, composto de mais de uma espécie. Muitos destes camarões são híbridos, o ancestral mitocondrial desta linhagem híbrida é o Caridina cantonensis, mesmo que esta espécie não tenha um aspecto de “Bee”. Qual (ou quais) foram as espécies que se misturaram ao C. cantonensis ainda é desconhecido. Baseado no fenótipo, e proximidade filogenética com o C. cantonensis, um forte candidato é, novamente, o C. logemanni.

Outra possibilidade para os camarões comprados em lojas é o Caridina venusta, um fato já sugerido por alguns autores Chineses, como Wang, Liang e Li em 2008.

Assim, é um erro renomear todos os camarões previamente identificados como Caridina cf. cantonensis por Caridina logemanni, como vêm fazendo inúmeros websites, portais e fóruns de aquarismo. Existe mais de uma espécie neste grupo de camarões, parte é composto pelo Caridina venusta, e boa parte por híbridos, possivelmente Caridina cantonensis x logemanni.

Este trabalho nos alerta também sobre a dificuldade que pode haver na identificação de espécies baseada somente em marcadores genéticos. A Taxonomia Genética é vista por muitos (leigos, e até alguns biólogos) como uma ferramenta definitiva, a “palavra final” na identificação de espécies. Vimos que não é bem assim.

Nos dias atuais, muito se fala de uma “Taxonomia Integrada” combinando informações de múltiplas fontes, incluindo comportamento, ecologia, geografia, morfologia e dados moleculares. Mesmo a análise genética deve ser de multi-marcadores, sempre que possível.

• Klotz W, von Rintelen T. 2014. To “bee” or not to be—on some Ornamental Shrimp from Guangdong Province, Southern China and Hong Kong SAR, with Descriptions of Three New Species. Zootaxa. 3889(2): 151–184.
• Palumbi SR, Cipriano F.Species identification using genetic tools: the value of nuclear and mitochondrial gene sequences in whale conservation. J Hered. 1998 Sep-Oct; 89(5): 459-64.
• Marshall DC, Hill KB, Cooley JR, Simon C. Hybridization, mitochondrial DNA phylogeography, and prediction of the early stages of reproductive isolation: lessons from New Zealand cicadas (genus Kikihia). Syst Biol. 2011 Jul; 60(4): 482-502.
• Shankaranarayanan P, Singh L. Mitochondrial DNA sequence divergence among big cats and their hybrids. Current Science (1998) 75 (9): 919–923.
• Roos C, Zinner D, Kubatko LS, Schwarz C, Yang M, Meyer D, Nash SD, Xing J, Batzer MA, Brameier M, Leendertz FH, Ziegler T, Perwitasari-Farajallah D, Nadler T, Walter L, Osterholz M. Nuclear versus mitochondrial DNA: evidence for hybridization in colobine monkeys. BMC Evol Biol. 2011 Mar 24;11:77.
• Moore WS. Inferring Phylogenies from mtDNA Variation: Mitochondrial-Gene Trees Versus Nuclear-Gene Trees. Evolution, Vol. 49, No. 4 (Aug., 1995), pp. 718-726.
• Yang L, Tan Z, Wang D, Xue L, Guan M, Huang T, Li R (2014) Species identification through mitochondrial rRNA genetic analysis. Sci Rep 4:4089.
• Cronin MA, Palmisciano DA, Vyse ER, Cameron DG. Mitochondrial DNA in Wildlife Forensic Science: Species Identification of Tissues. Wildlife Society Bulletin, Vol. 19, No. 1 (Spring, 1991), pp. 94-105.
• Mason PH, Short RV. Neanderthal-human Hybrids. Hypothesis 2011, 9(1): e1.
• Vargas SM, Soares L, Santos FR. Alelos exclusivos indicam introgressão em espécies de tartarugas marinhas. 54º Congresso Brasileiro de Genética (2008), Salvador, BA, Brasil.
• Lecher P, Defaye D, Noel P. 1995. Chromosomes and nuclear DNA of Crustacea. Invertebrate Reproduction and Development, 27, 85-114.
• Page TJ, Hughes JM. Neither molecular nor morphological data have all the answers; with an example from Macrobrachium (Decapoda: Palaemonidae) from Australia. 2011. Zootaxa, Vol. 2874, pp. 65-68.
• Klotz L. Das Merkmal „Tigerschaufel“ bei zwei chinesischen Süßwassergarnelenarten - eine morphometrische Analyse. Dissertação (Admissão no Programa de Biologia e Ciências Ambientais) – Oberstufenrealgymnasium privado St. Charles Volders. Volders, Áustria, 2012.
• Wang L, Liang X, Li F. Descriptions of four new species of Caridina (Decapoda: Atyidae) from China. 2008. Zootaxa, 1726, 49–59.
  

Agradecimentos especiais ao Dr. Werner Klotz e Dr. Thomas von Rintelen, que forneceram uma cópia do artigo em discussão para a nossa equipe. Somos gratos também ao fotógrafo Paul Ng Y.C. por permitir usar sua imagem do Caridina cantonensis selvagem.

As ilustrações de Walther Ishikawa, University of California e Connexions Web site estão licenciados sob uma Licença Creative Commons (veja links para imagens originais). As demais fotos têm seu "copyright" pertencendo aos respectivos autores.

Artigo publicado em 31/01/2015, última atualização em 07/02/2015